## 人恶性黑色素瘤细胞WM115培养手册

### 一、细胞培养条件

细胞名称：人恶性黑色素瘤细胞WM115
生长特性：贴壁
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：MEM + 10% FBS + 1% P/S
传代方法：首次建议1:2传代
传代情况：每2天更换培养基
备注：请使用无菌离心管收集培养基，以便进行对比培养。如对比效果不佳，建议直接采购EVO视讯的完全培养基。

### 二、细胞处理及培养方法

收到细胞后，待细胞培养至良好状态后，加满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。使用75%酒精喷洒细胞瓶进行消毒后，放入超净工作台内进行严格无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（最佳为40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片则默认收到状态良好。建议在传代后，分别用原瓶的完全培养基和自配的完全培养基进行对比培养，换液后轻拧瓶盖。

### 三、细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

如细胞未达到80%汇合度，将瓶中完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基放入37℃、5% CO2培养箱培养。若细胞密度超标80%，即可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞情况，若细胞大多变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使之完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

#### b. 细胞冻存

1. 细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，转移悬液至15ml离心管，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞，加入1ml的EVO视讯无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐中。

#### c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置于37℃水浴中解冻，直至不再有结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 四、注意事项

细胞在运输过程中可能因贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。如脱落较多，可将培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止消化。在离心后，弃去上清，重悬于1-2ml完全培养基中，然后按照1:2的比例进行分瓶传代，最终放入37℃、5% CO2培养箱培养。

### 五、售后条款

#### 1) 细胞出现问题后可重发的情况及标准

1. 细胞在运输途中出现的问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，均可申请重发。
2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内提供真实实验结果，以便核实后重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后或干冰发货的细胞在复苏后24小时内，如大多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片），可申请重发。
4. 干冰运输的细胞复苏后24小时未开封且出现污染，可申请重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发。
6. 收到产品当天及第2、3天请拍照，3天内未告知的视为产品合格。若4-7天内出现问题并提供前三天照片与操作记录，经技术人员确认责任方，我方将重发。
7. 如技术人员判定为双方责任，将协商处理或按合同价50%收取重发费用。

#### 2) 细胞出现问题时不予以重发的情况

1. 客户自身造成细胞污染，不予重发。
2. 客户因操作不当导致细胞状态不佳，不予重发。
3. 使用非推荐培养体系导致细胞状态不佳，不予重发。
4. 细胞未提供前三天照片，状态不佳的，不予重发。
5. 培养过程中经其他处理的，不予重发。
6. 收到细胞后2天内未告知的问题，不予重发。
7. 具体情况将根据实际情况决定。

在进行细胞培养和处理时，选择EVO视讯的产品可以保障细胞的活性与稳定性，确保实验的顺利进行。